非ゲノム情報による複製開始領域と複製タイミング制御メカニズムの解明
研究内容
真核生物のモデル生物代表選手である出芽酵母においては、複製開始点がコンセンサス配列に規定されており、染色体上全ての複製開始点が同定されています。一方、ヒト細胞を含む哺乳動物の複製開始点には明確なコンセンサス配列が存在せず、非ゲノム情報により制御されていることが知られています（図A）。これは、初期発生等ダイナミックに染色体が変化する状況では、コンセンサス配列できっちり複製開始点を決めないことが有利だったことを示しているのかもしれません。この性質のため、ヒト細胞においてはいくつかの代表的な複製開始領域を除けば、全ゲノムにおける詳細な複製開始点の位置や各々の活性は理解されておらず、従って非ゲノム情報との詳細な関連も明らかになっていません。
DNA複製においてはリーディング鎖が連続して合成されるのに対し、ラギング鎖として非連続的に合成される岡崎フラグメントは、後にDNAリガーゼによって連結されます。そこで、DNAリガーゼを阻害し、岡崎フラグメントを集めて方向性を特定したままシーケンスすれば、染色体上の複製開始点の位置と活性を網羅的に同定できます（図B）。このOkazaki sequence（OK-seq）法は、出芽酵母のDNAリガーゼ温度感受性変異株を用いておこなわれましたが、ヒト細胞においてはDNAリガーゼを効率よく不活化する方法が無かったため、おこなわれたことがありません。そこで、私たちの研究室で開発したオーキシンデグロン法をヒト細胞のDNAリガーゼLIG1とLIG3に応用し、リガンド添加によりLIG1とLIG3を数時間以内に分解除去することが可能なヒト細胞を作出しました（図C）。これらの細胞において、OK-seqをおこないS期における詳細な複製開始領域および複製フォークの移動パタンを検出することに成功しました（図D）。本技術を利用してS期初期から後期にかけての複製開始領域の変化と遺伝子発現や染色体構造との関係性を解析します。
主な論文
1. Saito, Y., Santosa V., Ishiguro, K., *Kanemaki MT. MCMBP promotes the assembly of the MCM2-7 hetero-hexamer to ensure robust DNA replication in human cells. eLife 11, e77393 (2022)
2. Negishi T., Kitagawa S., Horii N., Tanaka, Y., Haruta, N., Sugimoto, A., Sawa, H., Hayashi, H., *Harata, M., *Kanemaki MT. The auxin-inducible degron 2 (AID2) system enables controlled protein knockdown during embryogenesis and development in Caenorhabditis elegans. Genetics 220, iyab218 (2022)
3. *Kanemaki, MT. Ligand-induced degrons for studying nuclear functions. Curr Opin Cell Biol 74, 29-36 (2022)
4. Saito Y., *Kanemaki, MT. Targeted Protein Depletion Using the Auxin-Inducible Degron 2 (AID2) System. Curr Protocols 1, e219 (2021)
5. Yesbolatova, A., Saito, Y., Kitamoto, K., Makino-Itou, H., Ajima, R., Nakano, R., Nakaoka, H., Fukui, K., Gamo, K., Tominari, Y., Takeuchi, H., Saga, Y., Hayashi, K., *Kanemaki, MT. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nature Commun 11, 5701-5701 (2020)